نادي كلية العلوم - جامعة الازهر

اهلا وسهلا بكم في منتديات الميكروبيولوجي
Welcome to the Forums Microbiology

نادي كلية العلوم - جامعة الازهر


    طرق عد (إحصاء) وتنمية البكتيريا في المختبر

    شاطر
    avatar
    فؤاد بنات
    Admin

    عدد المساهمات : 360
    تاريخ التسجيل : 14/09/2010
    العمر : 28
    الموقع : http://3olom.yoo7.com
    06032013

    طرق عد (إحصاء) وتنمية البكتيريا في المختبر

    مُساهمة من طرف فؤاد بنات

    Microbiology
    القسم العملي

    Experiment Part

    تأليف: بروفسور دالية كريخلي و د. ميخال مندلوفيتش

    طرق الوقاية بالمختبر

    اقرأ بتمعن شديد وتصرف حسب هذه الإرشادات :

    1. قبل قدومك للمختبر, اقرأ التجربة جيداً بما في ذلك المقدمة النظرية وكذلك طرق العمل وافهم جيدا كل ما ورد . أثناء التجربة اقرأ كل بند وافهمه قبل أن تبدأ بالعمل . إستعن بالمرشدين للإجابة عن أي إستفسار أو سؤال يواجهك.

    2. لا تقم بعمل أي شيء لم يطلب منك عمله بشكل واضح في التعليمات أو عن طريق المعلم, مرشد أو فني المختبر. نشكرك على التعاون, ولكن أولاً يجب استشارة أعضاء الهيئة التدريسية الموجودين تحت تصرفك في المختبر, انك تعمل مع أجهزة غالية جداً ومواد خطرة. ان عدم الإنصياع للتعليمات و∕ أو تصرف غير لائق من الممكن ان يؤدي إلى كارثة !!

    3. لا تستخدم الفم ولا بأي حال من الأحوال لضخ السوائل بالماصة, استخدم فقط ماصة اتوماتيكية أو مضخة خضراء. انتبه, خلال إدخال الماصة إلى المضخة الخضراء, أمسك الماصة من الجزء العلوي, لا تستخدم قوة زائدة في إدخال الماصة لئلا تنكسر وتجرحك.

    4. لا يجوز الشرب ∕ الأكل∕ التدخين في المختبر!

    5. معالجة الأدوات المستخدمة والنفايات:

    · كل النفايات التي تتلامس مع مادة بكتيرية- ادخلها إلى كيس مكتوب عليه نفايات بكتيرية للإبادة .

    · كل أداة تتلامس مع مادة بكتيرية أدخلها إلى الوعاء الموضوع بجانب المغسلة, هذه الأدوات سوف يتم غسلها وتعقيمها.

    · كل النفايات التي لم تتلامس مع مادة بكتيرية- ادخلها إلى صندوق القمامة العلم الأوعية التي لم تتلامس مع مادة بكتيرية- اتركها فوق الصينية بصورة مرتبة.

    6. احرص على غسل يديك بالماء والصابون بنهاية المختبر.

    7. في حالة أي عطل بما في ذلك عدم انتظام الجهاز, استدع أي شخص من الأعضاء المرشدين فوراً.

    هدف التجربة The Experiment Purpose

    1. معرفة طرق عد (احصاء) خلايا البكتيريا .

    2. معرفة طرق صبغ خلايا البكتيريا .

    3. قياس منحنى نمو لخلايا البكتيريا (growth curve).

    4. التعرف على تأثير بعض العوامل على معدل نمو البكتيريا من نوع E.coli و Bacillus stearothermophilus

    في هذا المختبر سوف نقوم بالأمور التالية:

    ‌أ. تنمية البكتيريا E.coli من نوع B بثلاثة درجات حرارة مختلفة: بدرجة حرارة 37 ◦م وهي درجة الحرارة المثالية لهذه البكتيريا، بدرجة حرارة 55 درجة مئوية، وبدرجة حرارة الغرفة. كذلك سوف ننمي البكتيريا بوسط غذائي فقير، بتركيز ملح عالي، بظروف لا هوائية وبوجود مواد مضادة مختلفة Antibiotic. كذلك سوف ننمي البكتيريا Bacillus stearothermophilus بدرجتين مختلفتين من الحرارة. خلال فترة النمو سوف تأخذ عينة كل 20 دقيقة من أجل قياس درجة التعكر.
    ‌ب. أثناء فترة الانتظار، وعندما تعطى لك التعليمات سوف تقوم بعملية صبغة جرام gram للبكتيريا E.coli و Bacillus subtilus ، كذلك سوف تقوم بصبغة جرام لعينة تؤخذ من اللأسنان.

    ‌ج. القيام بالعد الحي للبكتيريا بواسطة سلسلة تخفيفات وزراعة البكتيريا على الصحون.



    لكي نقوم بتغطية كل هذه الإمكانيات، كل مجموعة ستقوم بتنفيذ ظروف مختلفة عن الأخرى وفي النهاية سنجمع نتائج كل الفرق.

    شرح عام General Explanation

    بغرفة المختبر هنالك 3 أحواض مائية متحركة كل واحد ذو درجة حرارة مختلفة: 37°C، 55°C ودرجة حرارة الغرفة. في كل مجموعة يوجد على الطاولة 5 أنابيب والتي تحوي بداخلها وسط غذائي لنمو البكتيريا. لكل مجموعة ملصقة بلون مختلف لكي نمنع الالتباس. الأنابيب معلمة بالأحرف A, B, C, D, E. الانابيب A,B,C مخصصة لفحص تأثير الحرارة على نمو البكتيريا وسوف نستعملها لتربية البكتيريا E.coli بثلاثة درجات حرارة مختلفة. الأنبوب A بـ37°C، B بدرجة حرارة الغرفة أما C ففي درجة حرارة 55°C. بالأنابيب D و E سوف تقوم كل مجموعة بفحص متغير إضافي حسب، الآتي:

    مجموعة أ : سوف تفحص معدل نمو البكتيريا E.coli بوسط غذائي فقير.

    مجموعة ب : سوف تفحص نمو E.coli بتركيز ملح عالي و بظرف شبه لاهوائي.

    مجموعة ج : سوف تقارن نمو E.coli حساس ومقاوم للأمبتسلين بوجود المادة المضادة أمبتسلين.

    مجموعة د : : سوف تفحص نمو E.coli بوجود المادتين المضادتين ستربتوميتسين و كلورمفنيكول.

    مجموعة ه : سوف نفحص نمو Bacillus stearothermophilus بدرجتا حرارة.

    عليك أن تفحص إلى أي مجموعة تنتمي وان تتصرف حسب التعليمات الخاصة بمجموعتك.

    مجرى التجربة The procedure

    • زراعة البكتيريا في الأنابيب.

    • قرائة درجة التعكر للبكتيريا ببداية التجربة ( زمن 0).

    • تنمية البكتيريا بالأحواض المائية.

    • قياس درجة التعكر بالسبكتروفوتومتر كل 20 دقيقة لمدة 100 دقيقة أو 120.

    • بعد قياس زمن 20 دقيقة سوف نقوم بعملية صبغ جرام.

    • بعد قياس زمن 40 و80 ستأخذ عينة للعد الحي:

    o العينة ستمر بسلسلة تخفيفات.

    o زراعة 3 صحون بتخفيضات 10–4 , 10-5 10-6.

    o عملية عد المستعمرات ستنفذ بعد 24 ساعة على الأقل من زراعتها.

    إجمالا عليك القيام بثلاث مهام: 1. منحنى لنمو البكتيريا. 2. صبغة جرام. 3. عد حي للبكتيريا.

    مجموعة أ

    زرع البكتيريا في الأنابيب

    1. أضف لكل الأنابيب من A إلى E ، بصورة معقمة بقرب النار، 500µl (ميكرولتر) بكتيريا E.coli من أنبوبة البكتيريا الموجودة بسلة الثلج.

    2. إمزج محتوى الأنابيب جيدا بواسطة التحريك بجهاز الـڤورتكس.

    قياس الزمن 0:

    3. أضبط جهاز السبكتروفوتومتر بطول موجة . 600 nm

    4. أضبط على الصفر جهاز السبكتروفوتومتر بمساعدة الأنبوب الذي يحتوي على سائل LB (وسط غذائي) الموجود على حامل الأنابيب (بمساعدة المرشد).

    5. قم بقياس درجة الإبتلاع (درجة التعكر) للأنابيب بالسبكتروفوتومتر (بمساعدة المرشد). إحرص على إدخال الأنابيب بحيث أن الخط العمودي الموجود على الملصق يتجه نحوك ( وذلك لكي لا تتأثر القرائة بالإختلافات بين جدار الأنبوب). قم بتسجيل النتيجة بالجدول في الحاسوب.

    تربية البكتيريا:

    6. ادخل كل أنبوب لداخل الحوض المائي المناسب:

    الأنابيب A، D و E للحوض ذو درجة حرارة 37°C.

    الانبوب B للحوض ذو درجة حرارة 25°C.

    الانبوب C للحوض ذو درجة حرارة 55°C.

    تأكد من تشغيل الإهتزاز بالأحواض!

    7. اضبط الساعة (TIMER) لـ 20 دقيقة وشغله.

    8. بالوقت المتبقي قم بعملية صبغ جرام حسب التعليمات لصبغ جرام بصفحة 19.

    قياس الزمن 20 دقيقة

    9. عند سماعك رنين الساعة قم بإخراج انابيب فرقتك من الاحواض المائية المختلفة.

    10. امسح الانابيب من الماء جيدا.

    11. قم بقياس درجة الإبتلاع للأنابيب بالسبكتروفوتومتر. إحرص على إدخال الأنابيب بحيث أن الخط العمودي الموجود على الملصق يتجه نحوك.

    12. قم بتسجيل النتيجة بالجدول في الحاسوب.

    13. ادخل كل أنبوب لداخل الحوض المائي المناسب. تأكد من تشغيل الإهتزاز بالأحواض!

    14. شغل الساعة لـ20 دقيقة.

    قياس الزمن 40 دقيقة

    15. عند سماعك رنين الساعة أخراج الانابيب من الاحواض المائية.

    16. امسح الانابيب من الماء جيدا.

    17. قم بقياس درجة الإبتلاع للأنابيب. إحرص على إدخال الأنابيب بحيث أن الخط العمودي الموجود على الملصق يتجه نحوك.

    18. قم بتسجيل النتيجة بالجدول في الحاسوب.

    أخذ عينة للعد الحي:

    19. أكتب على انبوب إبندوف 1a.

    20. ضع تيب ابيض على الماصة الأتوماتيكية لـ100µl.

    21. اسحب 100 ميكرولتر (0.1 ملل) ،بجانب النار، من الأنبوب A ثم ادخل السائل الى الأنبوب 1a. هذا الانبوب سوف تستعمل فيما بعد لاجراء التخفيفات والزرع والعد الحي.

    22. ارمي التيب.

    23. ادخل كل أنبوب لداخل الحوض المائي المناسب. تأكد من تشغيل الإهتزاز بالأحواض!

    24. شغل الساعة لـ20 دقيقة.

    25. بالوقت المتبقي قم بأجراء سلسلة التخفيفات والزراعة حسب التعليمات بصفحة 20.

    قياس الزمن 60 دقيقة:

    26. أعد المراحل من 9 الى 14.

    قياس الزمن 80 دقيقة:

    27. أعد المراحل من 9 الى 12.

    أخذ عينة للعد الحي:

    28. أكتب على انبوب إبندوف 1b.

    29. ضع تيب ابيض على الماصة الأتوماتيكية لـ100µl.

    30. اسحب 100 ميكرولتر (0.1 ملل) ،بجانب النار، من الأنبوب A ثم ادخل السائل الى الأنبوب 1b. هذا الانبوب سوف تستعمل فيما بعد لاجراء التخفيفات والزرع والعد الحي.

    31. ارمي التيب.

    32. ادخل كل أنبوب لداخل الحوض المائي المناسب. تأكد من تشغيل الإهتزاز بالأحواض!

    33. شغل الساعة لـ20 دقيقة.

    34. بالوقت المتبقي قم بأجراء سلسلة التخفيفات والزراعة حسب التعليمات بصفحة 20.

    قياس الزمن 100 دقيقة:

    35. أعد المراحل من 9 الى 14.

    36. إذا كانت هنالك حاجة (او اذا رغبت بذلك) أضف 20 دقيقة أخرى لنمو البكتيريا.

    مجموعة ب

    زرع البكتيريا في الأنابيب

    1. أضف لكل الأنابيب من A إلى D ، بصورة معقمة بقرب النار، 500µl (ميكرولتر) بكتيريا E.coli من أنبوبة البكتيريا الموجودة بسلة الثلج. للانبوب E أضف 2 ملل بكتيريا (2 X 1000µl).

    2. إمزج محتوى الأنابيب A الى D بواسطة الـڤورتكس. اما الانبوب E فاغلق بواسطة ورق البرافيلم الشفاف، ثم امزج الانبوب بواسطة قلب الانبوب بلطف. ابقي ورق البرافيلم على الانبوب وذلك لمنع الهواء من الدخول الى الانبوب.

    قياس الزمن 0:

    3.

    أضبط جهاز السبكتروفوتومتر بطول موجة . 600 nm

    4. أضبط على الصفر جهاز السبكتروفوتومتر بمساعدة الأنبوب الذي يحتوي على سائل LB (وسط غذائي) الموجود على حامل الأنابيب (بمساعدة المرشد).

    5. قم بقياس درجة الإبتلاع (درجة التعكر) للأنابيب بالسبكتروفوتومتر (بمساعدة المرشد). إحرص على إدخال الأنابيب بحيث أن الخط العمودي الموجود على الملصق يتجه نحوك ( وذلك لكي لا تتأثر القرائة بالإختلافات بين جدار الأنبوب). قم بتسجيل النتيجة بالجدول في الحاسوب.

    تربية البكتيريا:

    6. ادخل كل أنبوب لداخل الحوض المائي المناسب:

    الأنابيب A و D للحوض ذو درجة حرارة 37°C.

    الانبوب B للحوض ذو درجة حرارة 25°C.

    الانبوب C للحوض ذو درجة حرارة 55°C.

    تأكد من تشغيل الإهتزاز بالأحواض!

    7. ادخل الانبوب E الى الحاضن بدرجة حرارة 37°C (استعن بالمرشد).

    8. اضبط الساعة (TIMER) لـ 20 دقيقة وشغله.

    9. بالوقت المتبقي قم بعملية صبغ جرام حسب التعليمات لصبغ جرام بصفحة 19.

    قياس الزمن 20 دقيقة:

    10. عند سماعك رنين الساعة قم بإخراج انابيب فرقتك من الاحواض المائية ومن الحاضن.

    11. امسح الانابيب من الماء جيدا.

    12. قم بقياس درجة الإبتلاع للأنابيب بالسبكتروفوتومتر. إحرص على إدخال الأنابيب بحيث أن الخط العمودي الموجود على الملصق يتجه نحوك.

    13. قم بتسجيل النتيجة بالجدول في الحاسوب.

    14. ادخل الأنابيب A إلى D لداخل الحوض المائي المناسب. تأكد من تشغيل الإهتزاز بالأحواض!. ارجع الانبوب E الى الحاضن.

    15. شغل الساعة لـ20 دقيقة.

    قياس الزمن 40 دقيقة:

    1. عند سماعك رنين الساعة أخراج الانابيب من الاحواض المائية ومن الحاضن.

    2. امسح الانابيب من الماء جيدا.

    3. قم بقياس درجة الإبتلاع للأنابيب. إحرص على إدخال الأنابيب بحيث أن الخط العمودي الموجود على الملصق يتجه نحوك.

    4. قم بتسجيل النتيجة بالجدول في الحاسوب.

    أخذ عينة للعد الحي:

    5. أكتب على انبوب إبندوف 1a.

    6. ضع تيب ابيض على الماصة الأتوماتيكية لـ100µl.

    7. اسحب 100 ميكرولتر (0.1 ملل) ،بجانب النار، من الأنبوب A ثم ادخل السائل الى الأنبوب 1a. هذا الانبوب سوف تستعمل فيما بعد لاجراء التخفيفات والزرع والعد الحي.

    8. ارمي التيب.

    9. ادخل الأنابيب A إلى D لداخل الحوض المائي المناسب. تأكد من تشغيل الإهتزاز بالأحواض!. ارجع الانبوب E الى الحاضن.

    10. شغل الساعة لـ20 دقيقة.


    _________________



    متميزون ونسعى للتميز
    مُشاطرة هذه المقالة على: Excite BookmarksDiggRedditDel.icio.usGoogleLiveSlashdotNetscapeTechnoratiStumbleUponNewsvineFurlYahooSmarking


      الوقت/التاريخ الآن هو الخميس نوفمبر 23, 2017 11:09 am